TONIX 製藥控股公司 8-K

展品 99.02

在低鎂配方中具有增強顱面抗感受作用的催產素類似物 Darryl Rideout，博士 1*，Bruce Daugherty，博士 1，David T.，Ph.D. 1，David T.Su，博士 1，謝新民，博士 2，David Yeomans，博士 3，Brent Stranix，博士 4，Daniel St-Cyr，博士學位，1 月 4 日-費利克斯·斯科爾特斯，博士 4，克里斯托瓦爾·阿罕布拉，博士 4，Luciana Leo，博士 5，Sam R.J. Hoare，博士 5。，塞思·萊德曼，醫學博士 1，格雷戈裏·沙利文，醫學博士 1 1 Tonix 製藥公司，主街 26 號，新澤西州查塔姆 07928 2 AfasCI 研究實驗室，加利福尼亞州雷德伍德城第二大道 522 號 94063 3 斯坦福大學麻醉學、圍手術期和疼痛醫學系 300 Pasteur Drive，H3580 室 MC 5640 加利福尼亞州斯坦福 94305 4 X-Chem, Inc. 4800 Rue Levy——200 套房，魁北克省蒙特利爾 H4S 1Z9 5 Montana Molecular，366 Gallatin Park Dr.，蒙大拿州博茲曼 59715 在美國化學學會 2024 年春季會議 2024 年 3 月 20 日 www.tonixpharma.com 演示結果圖 2b Meyerowitz Mg 水合物與 OT OTR 結合的討論和結論簡介圖 4 P-1 和 G-2 雄性大鼠在 4 m g 時的抗感受圖 5 3-D 模型計算的 OTR（綠色碳）、Mg2+（深紅色）、H2O（紅色、白色）和 OT（洋紅色碳）圖 7 C-纖維 P-1（300 mM 對 0 mM，Bharadwaj）和 G-2（1.75 mM 對 0.5 mM）的抗感受性 Mg2+ 依賴圖 3 高 Mg2+ 時 Ephys 與 Gq 的對比 Gq 簡介鼻內催產素（OT）是一種治療動物模型中顱面疼痛的非阿片類鎮痛藥。正在考慮使用它來治療顱面疼痛，包括三叉神經痛，並且正在進行暴飲暴食症、青少年肥胖症和社交焦慮症的臨牀試驗。但是，OT與催產素受體（OTR）結合的體外和體內OT活性表現出Mg 2 +依賴性，在高Mg 2 +濃度的製劑中觀察到最大活性。結構研究表明，水合Mg 2 +在活性複合物中形成OT和OTR之間的重要橋樑，並在OT的激動效力中起着關鍵作用。我們的目標是找出對Mg 2 +依賴性降低的OT類似物，以最大限度地減少患者內部和患者之間與Mg 2 +相關的藥物活性波動。對齧齒動物三叉神經節（TG）神經元的電子生理學（ePHYs）研究是在OT和類似物上進行的。本文的結果將表明，用羥烷基和二羥烷基殘留物替代催產素中的7-脯氨酸有時會在低Mg 2 +時增加Emax（以mV為單位的超極化），並顯著降低對Mg 2 +的依賴性。將討論結構與活性的關係以及抗感受藥物發現的潛力。實驗方法——化學合成化學設計與合成羥基化 OT 類似物 P-2 和 G-1 至 G-5（表 1，圖 2）的設計目的是增加活性並降低相對於 OT 的 Mg 2 + 依賴性。 合成了受保護的 N-羥基烷基和 N-二羥基烷基甘氨酸衍生物（例如圖 1）或作為化合物 G-1 至 G-5 的前體購買。然後，在CTC樹脂上進行改性Fmoc固相合成，由受保護的氨基酸和氨基酸（如構件）合成G 1-G 5，然後進行選擇性裂解、去保護和大環封閉以形成催產素類似物（如Ichinose等人，2019年）。所得的環狀九肽使用半製備反相高效液相色譜純化，並通過LC/MS和HNMR進行表徵。生物學分析通過測量 Gq（Emax 和 EC 50）和 DAG 信號傳導，在表達培養的 HEK-293 T 細胞的 G（蛋白 OTR）中測定了體外激動作用。通過測量對神經元興奮性的影響，對從雄性大鼠身上新分離出來的小直徑三叉神經節（TG）神經元進行了體外電生理學（ePHYs）（Bhadarwaj等人，2022年）。Ephys 的結果以 mV 為單位進行測量。在低和高 Mg 2 + 下，Ephys E 值的標準差範圍為 0. 1 到 1. 2 mV（10 nM 配體），0. 3-1. 8 mV，100 nM 配體，100 nM 配體，100-0 nM 配體，0. 1 到 1 mV（表 1）。在一個涉及激光加熱刺激反應潛伏期的模型中，對患有顱面疼痛的大鼠的抗感受作用進行了鼻內測量（Bhadarwaj 等人。 ，2022年）。體外 Gq 檢測。這些研究是在OTR（表達培養的HEK-293 T細胞）中進行的，方法是測定Emax和EC 50以確定DAG的初始增長率和最大可實現的DAG。我們專注於 Emax，以實現 OT 可實現的最大 DAG。表 1 顯示了 OT 和 4 個類似物可實現的最大 DAG 的 Emax。在高（1. 75 mM）Mg 2 +時，OT 和 4 類似物的 ephys 結果隨着 Gq 活性增加（圖 3）呈上升趨勢，Gq 可以區分激動劑和拮抗劑（Meyerowitz 等人，2022年）。在進行更低通量的 ephyS 檢測之前，Gq 可用於清除拮抗劑和弱激動劑，但不適用於鑑定 ePHY 中具有所需較小鎂依賴性的 OT 類似物。ePhys。通過測量對神經元興奮性的影響，從雄性大鼠身上新分離出小直徑齧齒動物三叉神經節（TG）神經元。與原生 OT 相比，一些顯示 Gq 激動作用的類似物（尤其是 G-2）會產生 TG 神經元的強大超極化，對Mg 2 +的依賴性要低得多。根據Gq結果和結構（在7-殘基處存在羥烷基——參見圖2和表1中的P-2和G-1至G-5）確定了六種候選藥物。即使是 7 位單醇，如 P-2 和 G-5，也顯示出 Mg 2 + 依賴性（Mg 2 + 依賴性 2. 8 和 3. 8 mV）明顯低於位點 7 沒有羥基的催產素（Mg 2 + 依賴性 = 9 mV）。二極管（G-1-G 4）顯示出更大範圍的 Mg 2 + 依賴值。 在 OT 模擬二元醇中，位於 7 的脯氨酸被 N-3-羥丙基甘氨酸的衍生物所取代（參見圖 2 和表 1）。這4種二元醇中第二羥基的位置至關重要。這很可能是因為它會影響Mg 2 +相對於OTR的位置。例如，與 G-2（Mg 2 + 依賴關係-1 mV 和 9. 5 mM Mg 2 +）的 ephys 值比 G-2（Mg 2 + 依賴性-1 mV 和 9. 5 mM Mg 2 +）的活性低得多，對 Mg 2 + 的依賴性要低得多，儘管它們的區別只有一個碳原子。目前正在對OT模擬物/Mg 2 +/OTR複合物進行計算機建模研究，以更好地瞭解SAR。顱面抗感受藥。模擬劑R 721在Ephys中顯示出對Mg 2 +的依賴性可以忽略不計，在低Mg 2 +時活性最強（表1），當在由A-delta或C纖維傷害感受器激活介導的顱面疼痛大鼠模型中鼻內給藥時，它還能產生有效的體內鎮痛（圖4）。P-1（OT）和G-2（R 721）以劑量依賴的方式對C和A-delta纖維反應均具有鎮痛作用。G-2（R 721）幾乎沒有或根本沒有抗感受劑Mg 2 +依賴性（圖 7，表 2）。在低劑量的 OT 或類似物（4 ug）下，G-2（R 721）比低 Mg 2 + 時的 P-1（OT）更有效（圖 4）。討論結構研究表明，Mg 2 + 位於 OT-Mg 2 +-OTR 複合物的界面中，這為 Mg 2 + 依賴關係提供了機械學解釋。 在水中，最穩定的鎂2+配位球由6個直接與鎂配位的內部球體水分子和3個外球體水分子組成（Adrian-Scotto等人，2005年）。同樣，圖 5（基於基於 cyro-em 的 OT-Mg 2 +-OTR PDB 結構 7 RYC 和圖 4 b，在 Meyerowitz 等人中，圖 4 b 的初步模型，使用三維-RISM 方法放置水分子）進行了重新計算。結果由一個由6個水組成的內球體和OT受體殘留物D 100 I（圖5）組成，外圈由OT殘留物P 7和OTR殘留物E 42，可能還有R 34組成（另見Meyerowitz等人，2022年的圖4 b）。值得注意的是，Mg 2 + 離子及其相關的水分子構成了活性複合物中 OT 和 OTR 之間的重要橋樑。含有甘氨酸殘基和羥基化殘基絲氨酸和蘇氨酸的肽的柔韌性是相應的含脯氨酸肽的100倍以上（Huang和Nau，2003）。這表明，替換催產素類似物中的OT脯氨酸7-N-二羥基甘氨酸（如G-1至G-4）將為二醇氧進入OT P 7和Mg 2 +之間的綠色圓圈區域帶來足夠的靈活性（見圖5）。此外，對雙齒抑制劑batimastat與MMP-12（PDB 1 JK 3）中Zn 2 +離子結合的研究表明，配體中的兩種氧取代了兩個Zn 2 +結合的水。（陳等人，2019）。這表明，二醇G-1至G-4有可能充當直接與Mg 2 +結合的雙齒配體。 P-2 和 G-5 中的單氧對低 (0. 5 mM) Mg 2 + 中 1 uM (1000 nM) 配體的 Emax 值影響不大：A (OT) 為 6. 5 mV，單醇 B 為 8.5 mV，單醇 G-5 為 6.0 mV（見表 1）。但是，對於 0. 5 mM Mg 2 + 處的 10 nM 配體，效果更為明顯。儘管結構差異很小，但在 1、2 或 1、3-二醇（G-1 到 G-4）中的一對 OH 基團會導致 0. 5 mM Mg 2 +（0. 5 到 10 mV）處的 Emax 範圍要大得多。這表明，OTA上兩種羥基氧與Mg 2 +之間的特定相互作用可以增強或幹擾Mg 2 +/OTR的相互作用，具體取決於它們的位置。結構-活性-關係評估表明，G-2和相關OT類似物中改變的殘留物直接絡合Mg 2 +是其減少對Mg 2 +的依賴以及相對OT活性增加的原因。對於催產素，Ephys Mg 依賴性（圖 6）和顱面傷害感受 Mg 依賴性（圖 7）隨着 OT 濃度的增加而增加。在顱面傷害感受中，鎂對配體劑量的依賴性增加會導致低 Mg 時呈現-形（倒置 U 形）的劑量反應曲線。Bharadwaj、Yeomans等人，2022年）在逆轉阿片類藥物誘發的呼吸抑制的大鼠研究和自閉症臨牀研究（Yamasue、Kojima、Kuwabara等人，2022年）中，已經觀察到這種形狀的劑量反應曲線。我們最有前途的化合物R 721（G-2）由於其隨着劑量的增加而降低了對鎂的依賴性（圖7），預計不會在抗感受中顯示出形狀的劑量反應曲線。結論總之，鼻內注射R 721和相關OT類似物，在7號位含有N-羥基烷基和N-二羥基甘氨酸，可能是治療顱面疼痛的候選非阿片類鎮痛藥。這些 OT 類似物不需要鼻內 OT 所需的補充 Mg 2 + 以獲得最大效力，從而避免了具有不同 PK 和生物分佈行為的兩種成分（配體和 Mg 2 +）劑量測定的複雜性。表 1 圖 6 Ephys Mg2+ 對 P-1 和 G-2 的依賴關係（1.75 mM 對 0.5 mM）參考文獻：A drian——Scotto 等人，2005 年 J. Mol。Structure THEOCHEM V728 (2005) pp 231 — 242 Bharadwaj，Yeomans 等人，2022 Pharmaceutics V14，文章 1105，鎂對催產素受體功能的影響 Brackley and Toney，2021，J Pharmacol Exp Ther V 378 pp 96 — 107，催產素受體激活拯救阿片類藥物——系統性芬太尼誘發的大鼠呼吸抑制 Chen 等人，Chem Rev. 2019 V119 第 1323 — 1455 頁，靶向金屬酶作為治療幹預參考文獻，續：Huang 和 Nau，2003 年，Angewandte Chemie Int.埃德。V 42，第 2269-2272 頁。肽中氨基酸的構象靈活性量表** Ichinose 等人，2019 年 J. Med。化學。V62，第 3297−3310 頁開發用於治療社交障礙的高效類似物和長效類似物的 Oxyt 硬幣——例如行為 Meyerowitz 等人，2022年，《自然結構與分子生物學》V 29，第 274 — 281 頁（2022）OT的低温電子學-OTR-Mg++ 複雜的補充信息 Yamasue、Kujima、Kuwabara 等人，2022 BRAIN 2022，第 1-10 頁 doi 10.1093 — 大腦 — awab291 一種具有更高生物利用度的新型鼻用催產素噴霧劑對自閉症的影響——隨機試驗表 2 低温和高温下A-纖維抗感受作用的比較Mg2+ 濃度圖 1 代表性合成（化合物 G-2）圖 2 表 1 的結構支架