TONIX 制药控股公司 8-K

展品 99.02

在低镁配方中具有增强颅面抗感受作用的催产素类似物 Darryl Rideout，博士 1*，Bruce Daugherty，博士 1，David T.，Ph.D. 1，David T.Su，博士 1，谢新民，博士 2，David Yeomans，博士 3，Brent Stranix，博士 4，Daniel St-Cyr，博士学位，1 月 4 日-费利克斯·斯科尔特斯，博士 4，克里斯托瓦尔·阿罕布拉，博士 4，Luciana Leo，博士 5，Sam R.J. Hoare，博士 5。，塞思·莱德曼，医学博士 1，格雷戈里·沙利文，医学博士 1 1 Tonix 制药公司，主街 26 号，新泽西州查塔姆 07928 2 AfasCI 研究实验室，加利福尼亚州雷德伍德城第二大道 522 号 94063 3 斯坦福大学麻醉学、围手术期和疼痛医学系 300 Pasteur Drive，H3580 室 MC 5640 加利福尼亚州斯坦福 94305 4 X-Chem, Inc. 4800 Rue Levy——200 套房，魁北克省蒙特利尔 H4S 1Z9 5 Montana Molecular，366 Gallatin Park Dr.，蒙大拿州博兹曼 59715 在美国化学学会 2024 年春季会议 2024 年 3 月 20 日 www.tonixpharma.com 演示结果图 2b Meyerowitz Mg 水合物与 OT OTR 结合的讨论和结论简介图 4 P-1 和 G-2 雄性大鼠在 4 m g 时的抗感受图 5 3-D 模型计算的 OTR（绿色碳）、Mg2+（深红色）、H2O（红色、白色）和 OT（洋红色碳）图 7 C-纤维 P-1（300 mM 对 0 mM，Bharadwaj）和 G-2（1.75 mM 对 0.5 mM）的抗感受性 Mg2+ 依赖图 3 高 Mg2+ 时 Ephys 与 Gq 的对比 Gq 简介鼻内催产素（OT）是一种治疗动物模型中颅面疼痛的非阿片类镇痛药。正在考虑使用它来治疗颅面疼痛，包括三叉神经痛，并且正在进行暴饮暴食症、青少年肥胖症和社交焦虑症的临床试验。但是，OT与催产素受体（OTR）结合的体外和体内OT活性表现出Mg 2 +依赖性，在高Mg 2 +浓度的制剂中观察到最大活性。结构研究表明，水合Mg 2 +在活性复合物中形成OT和OTR之间的重要桥梁，并在OT的激动效力中起着关键作用。我们的目标是找出对Mg 2 +依赖性降低的OT类似物，以最大限度地减少患者内部和患者之间与Mg 2 +相关的药物活性波动。对啮齿动物三叉神经节（TG）神经元的电子生理学（ePHYs）研究是在OT和类似物上进行的。本文的结果将表明，用羟烷基和二羟烷基残留物替代催产素中的7-脯氨酸有时会在低Mg 2 +时增加Emax（以mV为单位的超极化），并显著降低对Mg 2 +的依赖性。将讨论结构与活性的关系以及抗感受药物发现的潜力。实验方法——化学合成化学设计与合成羟基化 OT 类似物 P-2 和 G-1 至 G-5（表 1，图 2）的设计目的是增加活性并降低相对于 OT 的 Mg 2 + 依赖性。 合成了受保护的 N-羟基烷基和 N-二羟基烷基甘氨酸衍生物（例如图 1）或作为化合物 G-1 至 G-5 的前体购买。然后，在CTC树脂上进行改性Fmoc固相合成，由受保护的氨基酸和氨基酸（如构件）合成G 1-G 5，然后进行选择性裂解、去保护和大环封闭以形成催产素类似物（如Ichinose等人，2019年）。所得的环状九肽使用半制备反相高效液相色谱纯化，并通过LC/MS和HNMR进行表征。生物学分析通过测量 Gq（Emax 和 EC 50）和 DAG 信号传导，在表达培养的 HEK-293 T 细胞的 G（蛋白 OTR）中测定了体外激动作用。通过测量对神经元兴奋性的影响，对从雄性大鼠身上新分离出来的小直径三叉神经节（TG）神经元进行了体外电生理学（ePHYs）（Bhadarwaj等人，2022年）。Ephys 的结果以 mV 为单位进行测量。在低和高 Mg 2 + 下，Ephys E 值的标准差范围为 0. 1 到 1. 2 mV（10 nM 配体），0. 3-1. 8 mV，100 nM 配体，100 nM 配体，100-0 nM 配体，0. 1 到 1 mV（表 1）。在一个涉及激光加热刺激反应潜伏期的模型中，对患有颅面疼痛的大鼠的抗感受作用进行了鼻内测量（Bhadarwaj 等人。 ，2022年）。体外 Gq 检测。这些研究是在OTR（表达培养的HEK-293 T细胞）中进行的，方法是测定Emax和EC 50以确定DAG的初始增长率和最大可实现的DAG。我们专注于 Emax，以实现 OT 可实现的最大 DAG。表 1 显示了 OT 和 4 个类似物可实现的最大 DAG 的 Emax。在高（1. 75 mM）Mg 2 +时，OT 和 4 类似物的 ephys 结果随着 Gq 活性增加（图 3）呈上升趋势，Gq 可以区分激动剂和拮抗剂（Meyerowitz 等人，2022年）。在进行更低通量的 ephyS 检测之前，Gq 可用于清除拮抗剂和弱激动剂，但不适用于鉴定 ePHY 中具有所需较小镁依赖性的 OT 类似物。ePhys。通过测量对神经元兴奋性的影响，从雄性大鼠身上新分离出小直径啮齿动物三叉神经节（TG）神经元。与原生 OT 相比，一些显示 Gq 激动作用的类似物（尤其是 G-2）会产生 TG 神经元的强大超极化，对Mg 2 +的依赖性要低得多。根据Gq结果和结构（在7-残基处存在羟烷基——参见图2和表1中的P-2和G-1至G-5）确定了六种候选药物。即使是 7 位单醇，如 P-2 和 G-5，也显示出 Mg 2 + 依赖性（Mg 2 + 依赖性 2. 8 和 3. 8 mV）明显低于位点 7 没有羟基的催产素（Mg 2 + 依赖性 = 9 mV）。二极管（G-1-G 4）显示出更大范围的 Mg 2 + 依赖值。 在 OT 模拟二元醇中，位于 7 的脯氨酸被 N-3-羟丙基甘氨酸的衍生物所取代（参见图 2 和表 1）。这4种二元醇中第二羟基的位置至关重要。这很可能是因为它会影响Mg 2 +相对于OTR的位置。例如，与 G-2（Mg 2 + 依赖关系-1 mV 和 9. 5 mM Mg 2 +）的 ephys 值比 G-2（Mg 2 + 依赖性-1 mV 和 9. 5 mM Mg 2 +）的活性低得多，对 Mg 2 + 的依赖性要低得多，尽管它们的区别只有一个碳原子。目前正在对OT模拟物/Mg 2 +/OTR复合物进行计算机建模研究，以更好地了解SAR。颅面抗感受药。模拟剂R 721在Ephys中显示出对Mg 2 +的依赖性可以忽略不计，在低Mg 2 +时活性最强（表1），当在由A-delta或C纤维伤害感受器激活介导的颅面疼痛大鼠模型中鼻内给药时，它还能产生有效的体内镇痛（图4）。P-1（OT）和G-2（R 721）以剂量依赖的方式对C和A-delta纤维反应均具有镇痛作用。G-2（R 721）几乎没有或根本没有抗感受剂Mg 2 +依赖性（图 7，表 2）。在低剂量的 OT 或类似物（4 ug）下，G-2（R 721）比低 Mg 2 + 时的 P-1（OT）更有效（图 4）。讨论结构研究表明，Mg 2 + 位于 OT-Mg 2 +-OTR 复合物的界面中，这为 Mg 2 + 依赖关系提供了机械学解释。 在水中，最稳定的镁2+配位球由6个直接与镁配位的内部球体水分子和3个外球体水分子组成（Adrian-Scotto等人，2005年）。同样，图 5（基于基于 cyro-em 的 OT-Mg 2 +-OTR PDB 结构 7 RYC 和图 4 b，在 Meyerowitz 等人中，图 4 b 的初步模型，使用三维-RISM 方法放置水分子）进行了重新计算。结果由一个由6个水组成的内球体和OT受体残留物D 100 I（图5）组成，外圈由OT残留物P 7和OTR残留物E 42，可能还有R 34组成（另见Meyerowitz等人，2022年的图4 b）。值得注意的是，Mg 2 + 离子及其相关的水分子构成了活性复合物中 OT 和 OTR 之间的重要桥梁。含有甘氨酸残基和羟基化残基丝氨酸和苏氨酸的肽的柔韧性是相应的含脯氨酸肽的100倍以上（Huang和Nau，2003）。这表明，替换催产素类似物中的OT脯氨酸7-N-二羟基甘氨酸（如G-1至G-4）将为二醇氧进入OT P 7和Mg 2 +之间的绿色圆圈区域带来足够的灵活性（见图5）。此外，对双齿抑制剂batimastat与MMP-12（PDB 1 JK 3）中Zn 2 +离子结合的研究表明，配体中的两种氧取代了两个Zn 2 +结合的水。（陈等人，2019）。这表明，二醇G-1至G-4有可能充当直接与Mg 2 +结合的双齿配体。 P-2 和 G-5 中的单氧对低 (0. 5 mM) Mg 2 + 中 1 uM (1000 nM) 配体的 Emax 值影响不大：A (OT) 为 6. 5 mV，单醇 B 为 8.5 mV，单醇 G-5 为 6.0 mV（见表 1）。但是，对于 0. 5 mM Mg 2 + 处的 10 nM 配体，效果更为明显。尽管结构差异很小，但在 1、2 或 1、3-二醇（G-1 到 G-4）中的一对 OH 基团会导致 0. 5 mM Mg 2 +（0. 5 到 10 mV）处的 Emax 范围要大得多。这表明，OTA上两种羟基氧与Mg 2 +之间的特定相互作用可以增强或干扰Mg 2 +/OTR的相互作用，具体取决于它们的位置。结构-活性-关系评估表明，G-2和相关OT类似物中改变的残留物直接络合Mg 2 +是其减少对Mg 2 +的依赖以及相对OT活性增加的原因。对于催产素，Ephys Mg 依赖性（图 6）和颅面伤害感受 Mg 依赖性（图 7）随着 OT 浓度的增加而增加。在颅面伤害感受中，镁对配体剂量的依赖性增加会导致低 Mg 时呈现-形（倒置 U 形）的剂量反应曲线。Bharadwaj、Yeomans等人，2022年）在逆转阿片类药物诱发的呼吸抑制的大鼠研究和自闭症临床研究（Yamasue、Kojima、Kuwabara等人，2022年）中，已经观察到这种形状的剂量反应曲线。我们最有前途的化合物R 721（G-2）由于其随着剂量的增加而降低了对镁的依赖性（图7），预计不会在抗感受中显示出形状的剂量反应曲线。结论总之，鼻内注射R 721和相关OT类似物，在7号位含有N-羟基烷基和N-二羟基甘氨酸，可能是治疗颅面疼痛的候选非阿片类镇痛药。这些 OT 类似物不需要鼻内 OT 所需的补充 Mg 2 + 以获得最大效力，从而避免了具有不同 PK 和生物分布行为的两种成分（配体和 Mg 2 +）剂量测定的复杂性。表 1 图 6 Ephys Mg2+ 对 P-1 和 G-2 的依赖关系（1.75 mM 对 0.5 mM）参考文献：A drian——Scotto 等人，2005 年 J. Mol。Structure THEOCHEM V728 (2005) pp 231 — 242 Bharadwaj，Yeomans 等人，2022 Pharmaceutics V14，文章 1105，镁对催产素受体功能的影响 Brackley and Toney，2021，J Pharmacol Exp Ther V 378 pp 96 — 107，催产素受体激活拯救阿片类药物——系统性芬太尼诱发的大鼠呼吸抑制 Chen 等人，Chem Rev. 2019 V119 第 1323 — 1455 页，靶向金属酶作为治疗干预参考文献，续：Huang 和 Nau，2003 年，Angewandte Chemie Int.埃德。V 42，第 2269-2272 页。肽中氨基酸的构象灵活性量表** Ichinose 等人，2019 年 J. Med。化学。V62，第 3297−3310 页开发用于治疗社交障碍的高效类似物和长效类似物的 Oxyt 硬币——例如行为 Meyerowitz 等人，2022年，《自然结构与分子生物学》V 29，第 274 — 281 页（2022）OT的低温电子学-OTR-Mg++ 复杂的补充信息 Yamasue、Kujima、Kuwabara 等人，2022 BRAIN 2022，第 1-10 页 doi 10.1093 — 大脑 — awab291 一种具有更高生物利用度的新型鼻用催产素喷雾剂对自闭症的影响——随机试验表 2 低温和高温下A-纤维抗感受作用的比较Mg2+ 浓度图 1 代表性合成（化合物 G-2）图 2 表 1 的结构支架